W latach 1869-73 studiował w Warszawskiej Klasie Rysunkowej (m.in. u Wojciecha Gersona), 1875-77 w akademii w Monachium oraz w 1877-79 w Szkole Sztuk Pięknych w Krakowie (u Jana Matejki), w której w 1893-1911 był profesorem. Współzałożyciel towarzystwa Sztuka. Od 1934 profesor ASP w Warszawie. Wyjeżdżał za granicę, m.in. do Paryża, gdzie zetknął się z impresjonizmem.
Początkowo malowal obrazy historyczno-rodzajowe, później realistyczne portrety i modne sceny salonowe (Ujrzałem raz... 1884). Podczas pobytu na Ukrainie (1883-93) tworzył sceny kopania buraków, orki, przedstawienia rybaków i chłopów; podejmując w nich problematykę światła i koloru, zbliżył się do impresjonizmu. Po 1895 uległ na krótko wpływowi symbolizmu, po czym zwrócił się w kierunku swoistego koloryzmu. Posługując się głównie pastelem, akwarelą i tuszem, malował nastrojowe pejzaże (zwłaszcza tatrzańskie), zabytki architektury, pamiątki historyczne (cykl Skarbiec wawelski), martwe natury, zwłaszcza kwiaty. Tworzył także zróżnicowane stylistycznie, wnikliwe portrety. Od ok. 1918 zajął się głównie grafiką (techniki trawione, autolitografia). Prace graficzne Leona Wyczółkowskiego mają charakter malarski i odznaczają się wielką skalą rozwiązań formalnych (Tatry 1900, Teka Huculska 1910, Stara Warszawa 1916, Gościeradz 1924).
Twórczość Leona Wyczółkowskiego jest zaliczana do najwybitniejszych zjawisk artystycznych w sztuce polskiej przełomu XIX i XX wieku.